Диагноз по обломкам ДНК- 2 часть

Streck Cell-Free DNA BCT и Roche Cell-Free DNA Collection Tubes 

В настоящее время клиническая практика наблюдения за онкологическими больными обычно включает рентгенологическое исследование. Эта процедура имеет существенные недостатки, такие как облучение,  неудобства для пациента и высокие эксплуатационные расходы. 

Наличие циркулирующих в кровеносном русле нуклеиновых кислот позволяет преодолеть эти ключевые недостатки. В настоящее время разрабатываются методы наблюдения за онкологическим процессом, основанные на исследовании внеклеточной ДНК (cfDNA, вкДНК), циркулирующей в кровотоке. 

Феномен циркулирующей внеклеточной ДНК хорошо известен и достаточно изучен: 

• вкДНК характерна для более чем 90% здоровых индивидуумов; 

• количество вкДНК существенно возрастает при воспалении, повреждении тканей, физической нагрузке, беременности и т.д.

Фрагменты ДНК могут попадать в кровоток, как из нормальных клеток организма, так и опухолевых клеток. Циркулирующая опухолевая ДНК (ctDNA, цоДНК) - это внеклеточная ДНК, которую в кровоток выделяют клетки опухоли. 

В настоящее время цоДНК разрабатывается в качестве клинического инструмента («жидкая биопсия») для диагностики и наблюдения за онкологическими заболеваниями, без необходимости физического проведения биопсии. 

Получение цоДНК происходит посредством обычного взятия крови у пациента. Анализ состоит из  обнаружения и количественного определения мутаций-маркеров с использованием таких методов, как целевое секвенирование следующего поколения (NGS) и методы цифровой ПЦР (ddPCR и BEAMing). Результаты такого анализа в реальном времени представляют молекулярную картину динамики онкологического процесса и реакции опухоли на лечение. 

Многочисленные исследования продемонстрировали обоснованность использования циркулирующей опухолевой ДНК в клиническом диагностическом сценарии, однако ее применение затрудняется отсутствием стандартизированных операционных протоколов.

В частности, преаналитические переменные, такие как сбор образцов, длительность хранение и транспортировка на большие расстояния, оказывают существенное влияние на  целостность циркулирующей ДНК и ее пригодность для последующего тестирования. 

Регулярный анализ цоДНК требует, чтобы серийные образцы крови отбирались у пациентов в пробирки с антикоагулянтом, таким как этилендиаминтетрауксусная кислота калия (K3EDTA). Однако использование только антикоагулянта  K3EDTA для стабилизации образцов крови является существенным препятствием для долговременного сохранения вкДНК после венепункции. 

В выполненных ранее исследованиях было определено, что образцы крови, собранные в пробирки с K3EDTA, должны быть обработаны в течение 24 часов после венепункции, чтобы предотвратить лизис лейкоцитов и высвобождение в плазму геномной ДНК. Срок хранения образцов может быть увеличен за счет их охлаждения (4-6°C), но это значительно увеличивает стоимость доставки. Кроме того, отправка образцов в удаленные лаборатории происходит в условиях постоянного перемешивания и колебаний температуры, что, как известно, значительно увеличивают лизис лейкоцитов. K3EDTA категорически не подходит для длительного хранения образцов (> 24 ч) при комнатной температуре.

Следовательно, специальные пробирки, со стабилизатором внеклеточной ДНК, приобретают особое значение для точного выявления и количественного определения вкДНК в клинических исследованиях.

Коммерчески доступные пробирки для вкДНК соединяют в себе сбор, транспортировку и долгосрочное хранение образцов крови для последующего выделения и анализа вкДНК. Такие пробирки содержат консервационный буфер, который предназначен для стабилизации образца крови и предотвращения лизиса лейкоцитов при колебаниях температуры и перемешивании в течение длительного периода (более 10 дней).

Пробирка Cell-Free DNA BCT (Streck, США) содержит запатентованный буфер, стабилизирующий образцы цельной крови в процессе сбора, транспортировки и хранения, для последующего клинического анализа вкДНК. Образцы крови в пробирках Streck BCT стабильны в течение 14 дней после венепункции, в пределах температур 6-37°C. Обширные валидационные исследования пробирок Streck BCT, в сравнении со стандартными пробирками с K3EDTA, показали значительное снижение выхода геномной ДНК (gДНК) из лейкоцитов в плазму при различных условиях доставки образца. Существует коммерчески доступный похожий продукт - пробирки Roche Cell-Free Collection Tubes (Roche). Пробирки Roche также содержат стабилизирующий буфер, который, как утверждает производитель, предотвращает высвобождение gДНК в течение 7 дней после сбора в различных условиях поставки. 

Чтобы выявить возможные различия в стабильности вкДНК между пробирками Streck Cell-Free DNA BCT и Roche Cell-Free Collection Tubes, был проведен ряд исследований. Сравнивались концентрации вкДНК и уровни ее загрязнения геномной ДНК при хранении пробирок с образцами в  течение 14 дней с момента сбора при комнатной температуре (22°C). Был выбран 14-дневный период хранения, поскольку это максимальный период времени для поддержания стабильности образца, указанный производителем пробирок Streck BCT.

Кровь (~ 8,5–10 мл) брали у здоровых добровольцев венепункцией в пробирки  Streck Cell-Free DNA BCT и Roche Cell-Free Collection Tubes. У одного добровольца кровь была также взята в пробирки K3EDTA BD Vacutainer. Все образцы хранились при температуре 22°С.

Образцы обрабатывали в дни 0, 4, 7, 10 и 14 после сбора. В День 0 образцы обрабатывали в течение 2 часов после взятия крови. Плазму отделяли от эритроцитов центрифугированием. ДНК выделяли из плазмы с использованием набора QIAGEN для циркулирующей нуклеиновой кислоты.

Концентрацию плазменной ДНК измеряли на флуориметре. 

Разделение фрагментов ДНК по размерам выполняли с помощью капиллярного электрофореза. 

Количественное определение фрагментов ДНК длиной 35 - 10380 п.н. проводили по электрофореграмме (флуоресцентные пики). 

Это позволяло визуально различать вкДНК (длиной ~165 п.н.) и загрязнение геномной ДНК. 

Для каждого субъекта были рассчитаны различия в концентрациях вкДНК (Streck минус Roche).

Степень загрязнения образцов геномной ДНК в различные моменты времени выявляли с помощью капиллярного электрофореза. Размер фрагмента ДНК определяли по интенсивности флуоресценции (в единицах измерения FU). Большинство фрагментов вкДНК имеют длину приблизительно 165 п.н., тогда как gДНК состоит из более длинных высокомолекулярных фрагментов около 10 000 п.н. Таким образом, выявлялись образцы с загрязнением gДНК, возрастающим в течение пяти временных периодов.

Электрофореграммы для образцов День 0 и День 14, хранившихся в пробирках Streck и K3EDTA, показаны ниже. Графики дают визуальное представление об уровне вкДНК и начале ее загрязнения геномной ДНК. Пики ДНК количественно определяются между двумя маркерами: нижним (35 п. н.) и верхним (10 380 п. н.). Пик внеклеточной ДНК был идентифицирован между 150 и 200 п. н. Пики геномной ДНК сгруппированы вокруг верхнего маркера. Графики показаны для трех добровольцев. 

Электрофореграмма образца Streck в День 0 показывает пик вкДНК 182 п.н. при интенсивности флуоресценции 40 FU (А), два дополнительных пика 375 п.н. и 500 п.н. и фрагменты геномной ДНК от 4000 до 6000 п.н. при 10 FU. На 14-й день  флуоресценция пика вкДНК снизилась до 20 FU (В), геномная ДНК вблизи верхнего маркера имела ту же интенсивность флуоресценции, что и в образце Дня 0. Очевидного лизиса лейкоцитов и массового выхода gДНК не наблюдалось. 

 

2) Пробирки K3EDTA

В пробирке с K3EDTA определяли загрязнение внеклеточной ДНК в результате лизиса лейкоцитов в образцах, не содержащих клеточного стабилизатора. В образце K3EDTA День 0 был выявлен пик вкДНК 181 п.н. с флуоресценцией 18 FU и несколько фрагментов gДНК от 3000 до 8000 п.н. при <10 FU (E). На День 14  значительно увеличилось количество фрагментов ДНК и интенсивность их флуоресценции с наибольшим пиком 9000 п.н. при 2000 FU. Флуоресценция этих длинных фрагментов частично затеняет пик вкДНК (F). 

 

Таким образом, в пробирках с антикоагулянтом K3EDTA, без добавления клеточного стабилизатора, на 14-й день хранения при комнатной температуре содержится значительно больше высокомолекулярных фрагментов геномной ДНК (из-за лизиса лейкоцитов), по сравнению с образцами в пробирках Streck, в которые добавлен клеточный стабилизатор.

Для образцов, собранных в пробирки Streck BCT, не наблюдалось  статистически значимого изменения общей концентрации вкДНК между днями 0 – 4, 0 – 7, 0 – 10 и 0 – 14 (p > 0,05). Для образцов, хранящихся в пробирках Roche, средние концентрации вкДНК достоверно различались между днями 0 – 4, 0 – 7, 0 – 10 и 0 – 14 (p <0,05). Это свидетельствует о загрязнении геномной ДНК образцов Roche в результате лизиса лейкоцитов, начиная с 7-го дня хранения при комнатной температуре (Таблица 1).

Таблица 1
Парный анализ пробирок Streck	p-значение
День 0 и 4	0,4
День 0 и 7	0,1
День 0 и 10	1,1
День 0 и 14	1,6
	p> 0,05
Парный анализ пробирок Roche
День 0 и 4	0,2
День 0 и 7	0,01
День 0 и 10	0,046
День 0 и 14	0,002
	р <0,05